Радиоиммунологический анализ крови (РИА): применение

В 1956 г. они впервые обнаружили у больных, леченных инсулином, непреципитирующие антитела, способные связывать ¹³¹I-инсулин. Затем эта научная группа показала, что немеченый инсулин конкурирует с меченым за связывание с антителами и вытесняет его из иммунных комплексов. Впоследствии Berson и Yalow разработали первый метод РИА для измерения концентрации инсулина в сыворотке, за что они были удостоены Нобелевской премии. В этом методе инсулин, связанный с антителами, отделяли от несвязанного инсулина путем электрофореза на бумаге. Примерно в то же время, в 1960-х гг., Grodsky и Forsham описали сходный метод РИА с использованием ¹³¹I-инсулина, но для разделения связанного и несвязанного гормонов они вместо электрофореза применяли высаливание.

Огромный вклад в развитие РИА внесли Hales и Randle в 1963 г. Для разделения связанного и несвязанного гормонов они применили антитела против у-глобулинов, так называемые вторичные антитела. Этот подход основывался на результатах работ Skom и Talmadge, которые в 1958 г. показали, что вторичные антитела вызывают преципитацию комплексов «антиген—первичное антитело». Метод Hales и Randle, получивший название «метода двойных антител», оказался значительно более чувствительным и специфичным, чем прежние варианты РИА.

В 1963 г. Herbert et al. разработали методику отделения комплексов «антиген—антитело» от несвязанного антигена при помощи активированного угля, покрытого декстраном. В основе методики лежит свойство угольно-декстрановой смеси практически мгновенно абсорбировать свободный антиген, не связывая при этом комплексы антиген-антитело. Эта методика позволяет отделять иммунные комплексы гораздо быст7 рее, чем преципитационные методики, поэтому в ней можно использовать ¹³¹I-антигены с низкой удельной активностью, меченные по Hunter и Greenwood.

В то же самое время Utiger et al. расширили область применения РИА, разработав способ количественного определения человеческого СТГ. Позднее Greenwood et al. внедрили методику йодирования СТГ, позволяющую получать меченый гормон с удельной активностью 200— 500 мКи/мг (6000-9000 Ки/ммоль).

Эта методика используется и поныне. Суть ее заключается в том, что изотоп йода (1311 или 1251) в составе йодида натрия окисляется хлорамином Т и в таком виде замещает один или несколько атомов водорода в фенольном кольце тирозина и в имидазольном кольце гистидина. Через 1 мин к реакционной смеси добавляют восстановитель, чтобы избежать излишнего повреждения гормона. Отметим, что принцип окислительного йодирования белков был описан Hughes еще в 1957 г. В дальнейшем Meyer и Knobil разработали РИА для измерения человеческого и обезьяньего СТГ, в котором для отделения несвязанного гормона применялся активированный уголь.

Первый РИА для измерения уровня гонадотропных гормонов (в данном случае — ЛГ), разработанный в 1966 г., основывался на использовании антител к человеческому ХГ, поскольку ранее было показано, что эти антитела связываются и с человеческим ЛГ. Один из экспериментов в этой области произвел настоящую революцию в иммунохимии: Catt et al. обнаружили, что антитела способны прилипать к дискам из диазотированного полистирола. Таким образом, отпала необходимость в отделении комплексов антиген—антитело с помощью преципитации или абсорбции. Позднее Catt et al. научились иммобилизировать антитела непосредственно на ненасыщенном полистироле в щелочной среде. Результаты этих работ послужили основой для создания ИФА (см. ниже). Faiman и Ryan впервые сумели получить антисыворотку к гипофизарному гонадотропину — человеческому ЛГ. В дальнейшем были разработаны РИА для определения крысиного ЛГ.

Разработка РИА для измерения уровня ФСГ, как и в случае с ЛГ, начиналась с прицелом на будущие клинические исследования. В 1967 и 1968 гг. несколько научных групп сообщили о новых методах РИА для разных форм человеческого ФСГ. Все они были основаны на методе двойных антител.

В 1967 г. Aria и Lee впервые объявили о способе определения пролактина, основанного на методе двойных антител. Первые измерения уровня пролактина методом РИА были проведены, за отсутствием человеческого материала, в овечьей и бычьей плазме.

Теоретические основы РИА

Первые методы РИА (например, методы Berson и Yalow или Grodsky и Forsham) были основаны на феномене конкурентного ингибирования. Этот феномен заключается в том, что связывание меченого изотопом гормона (меченого антигена) со специфическими антителами подавляется в присутствии немеченого гормона (немеченого антигена). Феномен конкурентного ингибирования можно описать двумя уравнениями: «меченый антиген + антитело меченый комплекс» и «немеченый антиген + антитело <-> немеченый комплекс». Таким образом, число молекул меченого гормона, входящих в состав комплексов антиген—антитело, обратно пропорционально исходному числу молекул немеченого гормона в реакционной смеси. Иначе говоря, радиоактивность комплексов, отделенных от несвязавшихся антител и антигенов, будет тем выше, чем ниже была концентрация немеченого гормона.

Обычно РИА проводят при температуре 4 или 37°С в фосфатно-солевом буферном растворе при рН 7 или 8. Реакция может длиться от 2 до 24 ч (в зависимости от аффинности антител и желаемого уровня чувствительности). Отметим, что автоматизация анализа и усовершенствование способов получения антител значительно сократили время реакции. Когда в реакционной смеси устанавливается равновесие, комплексы антиген—антитело отделяют преципитацией с помощью вторичных антител, абсорбцией свободных антигенов и антител на активированном угле, или осаждением в среде с высокой плотностью, например в среде с полиэтиленгликолем. Если же это твердофазный РИА, то инкубационную среду просто удаляют, а комплексы антиген—антитело остаются на полистироле или другой твердой фазе. На последнем этапе измеряют радиоактивность комплексов. Если гормон был помечен ¹²⁵I или ¹³¹I, используют счетчик у-излучения, если меткой служил 3Н, используют сцинтилляционный счетчик β-частиц. Концентрации гормона в пробах рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по результатам измерений в стандартных образцах с известными концентрациями гормона.

Получение антител

Поликлональные антитела для РИА получают путем иммунизации антигеном (гормоном) животных разных видов, в том числе кроликов, кур, морских свинок, уток, коз и овец. Для получения первичных антител (против гормона) обычно используют кроликов и морских свинок, для получения вторичных антител (против первичных) — овец и коз.

Существует множество методов иммунизации, самый распространенный — инъекция антигена в подушечку лапы, или в регионарный лимфоузел, или в селезенку. Так как в организме хозяина антигены существуют очень недолго, для надежной индукции иммунного ответа используют адъювант Фрейнда. Неиммуногенные антигены с небольшой молекулярной массой (например, стероидные гормоны) и антигены с низкой иммуногенностью перед иммунизацией присоединяют к крупным молекулам или частицам (метилированному альбумину, ферритину, декстрану, сефадексу и т. п.). Обычно иммунизацию проводят в несколько этапов с интервалами в 2 недели. Как правило, после нескольких инъекций титр антител в сыворотке быстро растет. Кровь для получения иммунной сыворотки берут из полостей сердца или из вен и артерий уха. Последний способ чаще всего применяют у кроликов. Полученную сыворотку инкубируют 30 мин при 57°С для разрушения комплемента. Затем к сыворотке добавляют консервант, предотвращающий рост бактерий и грибов (азид натрия или тиомерсал).

Моноклональные антитела

В 1975 г. Kohler и Milstein разработали принципиально новую — гибридомную — технологию получения антител. Позже эта разработка была отмечена Нобелевской премией. Опишем основные элементы этой технологии.

Мышей или крыс иммунизируют антигеном, например гормоном. Когда титр антител в сыворотке становится достаточно высоким, у иммунных животных из селе зенки выделяют плазматические клетки среди которых есть и клетки — продуценты антител к исходному антигену. Плазматические клетки гибридизуют in vitro клетками миеломы, происходящими о животных того же вида. Затем клеточную суспензию переносят в селективную среду, в которой выживают только гибридные клетки, а плазматические и миелом ные клетки погибают. Гибридные клети по одной рассевают в лунки с питатель ной средой, где они делятся и образую гибридомы (бессмертные клеточные линии). Среди множества гибридом отбирают те, которые продуцируют антитела нужному антигену, и размножают их питательной среде либо в брюшной полости сингенных мышей. Из питательно; среды или асцитической жидкости выделяют антитела. Эти антитела называют моноклональными, поскольку они продуцируются гибридомой, являющейся потомком одной-единственной плазматической клетки. Моноклональные антитела, вырабатываемые одной гибридомой, распознают только одну детерминанту какого-либо антигена. В этом и состоит принципиальное отличие моноклональных антител от поликлональной антисыворотки, в которой обычно содержится несколько разных антител к различным детерминантам одного антигена.

Одно из важных преимуществ моноклональных антител перед поликлональными заключается в том, что один и тот же вид моноклональных антител с определенной специфичностью и аффинностью можно получать в любых количествах и практически бесконечно (поскольку гибридома бессмертна). Напротив, антительный состав поликлональных антисывороток весьма изменчив, что требует проверки каждой новой партии антисыворотки и подбора условий ее применения. Таким образом, использование моноклональных антител существенно облегчает стандартизацию РИА и других иммунохимических методов анализа.

Получение гормонов, меченных радиоактивными изотопами

Как уже говорилось, для йодирования белковых гормонов чаще всего применяют метод, предложенный Greenwood и Hunter. Изначально в качестве метки использовали ¹³¹I, но из-за короткого периода полураспада этого изотопа (8 сут) срок годности меченого гормона был невелик. В 1967 г. Wilde et al. применили для йодирования ¹²⁵I (Т_1/2 = 60 сут). С тех пор этот изотоп применяется для мечения любых белковых и некоторых небелковых гормонов. При этом получаются меченые гормоны с удельной активностью 100—250 мКи/мг. Этого вполне достаточно для надежной регистрации излучения на счетчике ϒ-частиц.

Для мечения небелковых гормонов используют и другие радиоактивные изотопы, такие как излучатели β-частиц ³H или ¹⁴C. Меченные ³H или ¹⁴C стероиды применяют не только в иммунохимическом анализе гормонов, но и в фундаментальных эндокринологических исследованиях, например для изучения локализации рецепторов стероидов в разных клетках и тканях экспериментальных животных.