D димер: что это такое, норма

В результате действия ферментного комплекса t-PA-плазминоген образуется фермент, способный разрушить сгусток фибрина, — плазмин. В процессе деградации фибрина, осуществляемой этим ключевым ферментом фибринолитической системы, от протофибриллы (-D=D-E-D=D-E-D=D-) отделяются D-димеры (-D=D-) и Е-фрагменты (-Е-). Поскольку в D-димере имеются D-D-связи (поперечные сшивки), которые отсутствуют в фибриногене, фибрин-мономере и рыхлом фибрин-полимере, повышение его концентрации в крови свидетельствует о реализации коагуляции и активации фибринолиза.

Принцип метода

Принцип метода ELISA основан на специфическом связывании D-димера с моноклональными антителами на поверхности микропланшета. После удаления субстанций, не связавшихся с микропланшетом, проводится инкубация с меченными ферментом антителами (конъюгат). В результате на поверхности микропланшета происходит присоединение антител, меченных ферментом, к уже имеющимся комплексам D-димер-анти-О-димер. Добавляемый после промывки 3,3',5,5'-тетраметилбензидин позволяет оценить активность фермента по характерному окрашиванию тестируемой смеси. Интенсивность окраски будет пропорциональна активности фермента и, соответственно, количеству аналита в пробе.

Реактивы и оборудование

• Ферментный конъюгат (кроличьи или козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена).
• Микропланшет с покрытыми антителами к D-димеру лунками.
• Калибратор/калибраторы.
• Буфер для образцов.
• Промывочный буфер.
• Раствор хромогена/субстрата (хромоген — тетраметилбензидин, субстрат — перекись водорода).
• Стоп-реагент (0,5 М серная кислота).
• Оборудование для выполнения ELISA (вошер, ридер для планшетов и др.).

Дистрибьютор диагностического набора реагентов — ЗАО «Биохиммак».

Образцы крови для исследования

В качестве образца для определения концентрации D-димера следует использовать плазму из стабилизированной натрия цитратом цельной крови. Особенности подготовки образцов детально рассмотрены в приложении 3.

Методика определения

Реагенты, входящие в состав набора, и планшет перед анализом должны иметь комнатную температуру. Последовательность действий врача-лаборанта при определении уровня D-димера должна строго соответствовать инструкции к набору реагентов.

Оценка результатов исследования Для измерения концентрации D-димера необходимо использовать калибровочную кривую. Калибраторы рекомендуется исследовать в дублирующих определениях, а также строить новую калибровочную кривую для каждой новой серии диагностического набора. Для построения калибровочного графика используют величины оптической плотности, полученные при выявлении разных концентраций D-димера.

Следует особо подчеркнуть, что на момент написания монографии нет общепризнанного стандарта D-димера, поэтому производители диагностических наборов используют различные образцы и единицы измерения для его определения. Кроме традиционного указания весового содержания в единице объема (мкг/л, нг/мл, мкг/мл, мг/л, нмоль/л), ряд производителей диагностических наборов рекомендуют результаты определения D-димера оценивать в единицах, эквивалентных фибриногену (FEU mg/L).

Эту особенность весьма важно учитывать, поскольку в разных вариантах представления результатов исследования фигурирует концентрация (мг/мл), а нормальный диапазон и результаты определения для разных единиц измерения отличаются примерно в 2 раза. Зачастую, в связи с отсутствием единого стандарта, различия на фоне многих патологических состояний (ДВС-синдром, ТЭЛА и ряд других) при использовании разных вариантов выражения результатов отличается более чем в 2 раза.

Формула для вычисления результатов определения концентрации D-димера в единицах Си: [нмоль/л] = [мкг/мл] х 5,476. Наиболее часто применяемые весовые единицы измерения соотносятся между собой следующим образом: 250 нг/мл = 0,25 мкг/мл = 0,25 мг/л = 250 мкг/л.

Нормальный диапазон концентрации D-димера должен определяться в каждой лаборатории с учетом особенностей оборудования и расходных материалов. Нормальный уровень D-димера, указываемый большинством производителей, составляет менее 250 мкг/л, менее 0,5 мг/л FEU. Поскольку период полувыведения D-димера составляет более 24 ч, его уровень довольно долго бывает стабильным.

Оценка результатов теста должна осуществляться с учетом определения правильности. Для осуществления контроля качества каждой лаборатории предлагается использовать контрольные материалы с учетом единиц измерения, рекомендуемых производителем.

Интерпретация результатов исследования

Определение концентрации D-димера часто используют для обнаружения тромбозов и тромбоэмболий. Специфичность этого показателя по отношению к тромботическим нарушениям ограничена, поскольку данный показатель возрастает и при многих других патологических состояниях.

Несмотря на ограниченную специфичность теста, его информативность при тромбозах и тромбоэмболиях весьма высока, поскольку тест демонстрирует очень хороший негативный прогностический уровень, т. е. отрицательный результат анализа практически всегда свидетельствует об отсутствии тромбоэмболических процессов.

Высокий уровень D-димера необходимо интерпретировать с учетом результатов других анализов и клинической картины заболевания. Этот показатель также используют для оценки эффективности антитромботической терапии.

Другие аналитические технологии Кроме ELISA, для определения D-димера применяют и другие иммунохимические технологии (иммунотурбидиметрия, иммунохемилюминесценция, латекс-агглютинация, иммунохроматография, мембранная иммунодиффузия). На рынке довольно широко представлены полуколичественные методы его определения. Многие современные модели автоматических и полуавтоматических коагулометров способны количественно определить уровень D-димера с помощью иммунотурбидиметрии.

Причины ошибок

• Несоблюдение температурного режима хранения.
• Нарушение процедуры промывки (при ручной промывке нужно промывать не менее 3-4 раз). После осуществления промывки осушите планшет на фильтровальной бумаге, поскольку жидкость, обычно остающаяся в лунках после промывки, может помешать действию субстрата и снизить оптическую плотность исследуемого образца.
• Смешивание реагентов из различных лотов.
• Конденсация влаги внутри лунок. Для предупреждения возникновения конденсата не следует вскрывать пакет до тех пор, пока он не прогреется до комнатной температуры.