11-дегидротромбоксан В2: метод определения

Предшественником тромбоксана А₂ служит арахидоновая кислота, которая накапливается в клетках при активации фосфолипаз. Под действием циклооксигеназы-1 арахидонат превращается в короткоживущие простагландины G2 и Н2, далее — в тромбоксан А₂. Образующийся и высвобождающийся тромбоксан А₂ вызывает быструю необратимую агрегацию тромбоцитов и дополнительный спазм сосудов малого калибра. В процессе метаболизма этого вещества в печени образуется тромбоксан B₂, а далее — 11-дегидротромбоксан B₂, удаляемый из организма с мочой.

Поскольку период полужизни тромбоксана А„ составляет лишь 30 с, мониторинг продукции этого вещества in vivo обычно проводят косвенно, по определению тромбоксана В, в плазме крови или более стабильного его метаболита — 11-дегидротромбоксана B₂ — в моче.

Принцип метода

Методики количественного определения 11-дегидротром-боксана B₂ основаны на технологиях EL1SA.

Реактивы и оборудование

• Лунки микропланшета, покрытые антителами к 11-дегидротромбоксану B₂.
• Калибратор/калибраторы.
• Ферментный конъюгат (кроличьи или козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена).
• Буфер для образцов.
• Промывочный буфер.
• Раствор хромогена/субстрата (хромоген — тетраметилбензидин, субстрат — перекись водорода).
• Стоп-реагент.
• Оборудование для выполнения ELISA (вошер, ридер для планшетов и др.).

Образцы мочи для исследования

Концентрация 11-дегидротромбоксана B₂ наиболее часто исследуют в утренней порции мочи. Для предупреждения образования тромбоксана и его метаболитов in vitro в образцы мочи добавляют ингибиторы простагландинсинтетаз (индометацин или меклофенамовая кислота).

Техника выполнения

Последовательность действий врача-лаборанта при определении уровня 11-дегидротромбоксана B₂ должна строго соответствовать инструкции к набору реагентов. Калибраторы рекомендуется исследовать в дублирующих определениях и использовать новую калибровочную кривую для каждой серии диагностического набора.

Оценка результатов исследования

У здоровых лиц диапазон концентраций 11-дегидротром-боксана B₂ в моче составляет 40-240 нг/ммоль креатинина (350-2100 нг/г креатинина). Рекомендуется сформировать контрольную группу и самостоятельно определить диапазон нормальных значений для каждой лаборатории.

Обязательно исследование контрольных образцов с известной концентрацией 11-дегидротромбоксана B₂.

Интерпретация результатов исследования

Уровень 11-дегидротромбоксана B₂ служит наиболее объективным биохимическим показателем аспиринорезистентности, о чем свидетельствуют высокие значения этого вещества в моче на фоне лечения препаратами, содержащими ацетилсалициловую кислоту. Напротив, о чувствительности к аспирину, по данным ряда авторов, может свидетельствовать 50%-е снижение уровня 11-дегидротромбоксана B₂ в моче на фоне приема внутрь 325 мг аспирина в сутки.

Определение 11-дегидротромбоксана В, возможно использовать для оценки активации тромбоцитов при разных заболеваниях. Имеется информация о связи высоких значений 11-дегидротромбоксана B₂ в моче с развитием осложнений атеросклероза: инфарктов, инсультов и др., в т. ч. у пациентов, получающих антиагрегантную терапию.

Причины ошибок

• Гемолиз.
• В образцах мочи, содержащих лейкоциты и эритроциты, возможно ложное завышение уровня 11-дегидротромбоксана B₂.
• Несоблюдение температурного режима при хранении реагентов.
• Конденсация влаги внутри лунок (для предупреждения возникновения конденсата не следует вскрывать пакет до тех пор, пока он не прогреется).

Другие аналитические технологии Определение уровня 11-дегидротромбоксана B₂ основано на учете взаимодействия антигена и антитела, поэтому для его количественного учета разработаны и другие технологии, позволяющие выявить компоненты иммунного взаимодействия, например радиоиммуноанализ с меткой I¹²⁵.