Неизотопные методы иммунохимического анализа гормонов

Это был первый метод точного количественного определения гормонов, получивший широкое распространение и сыгравший огромную роль в лабораторной диагностике эндокринных нарушений. Именно на базе РИА сформировались современные принципы иммунохимического анализа гормонов. Однако за последние двадцать лет РИА был почти полностью вытеснен из клинической практики неизотопными методами иммунохимического анализа — ИФА и иммунохемилюминесцентным анализом. В основе этих методов, так же как и в основе РИА, лежит взаимодействие антигенов и антител, но в качестве метки используются не радиоактивные изотопы, а ферменты, катализирующие реакции с образованием окрашенного продукта, либо люминесцирующие вещества. В первом случае на конечном этапе анализа измеряют оптическую плотность реакционной смеси, во втором — количество квантов, испускаемых люминесцирующим веществом.

Иммуноферментный анализ

Для количественного определения гормонов чаще всего применяют твердофазный ИФА с двумя антителами. Его проводят в многолуночных пластиковых  планшетах. На дне лунок сорбированы моноклональные антитела, специфичные к определенной антигенной детерминанте гормона. В лунки вносят пробы сывороток с неизвестными концентрациями гормона либо стандартные образцы с известными концентрациями гормона. Планшет инкубируют 30—120 мин; за это время молекулы гормона успевают связаться с антителами, сорбированными на пластике. После инкубации лунки промывают буферным раствором для удаления несвязавшегося гормона и прочих компонентов сыворотки. Затем в лунки вносят поликлональные антитела к гормону, конъюгированные с пероксидазой (так называемый конъюгат), и инкубируют планшет 15—30 мин. При этом молекулы конъюгата связываются с молекулами гормона. Лунки вновь промывают для удаления несвязавшегося конъюгата и добавляют в них раствор, содержащий неокрашенный субстрат пероксидазы. Пероксидаза превращает этот субстрат в окрашенный продукт. Интенсивность окрашивания растворов в лунках (ее измеряют на фотометре) прямо пропорциональна количеству конъюгата в лунке, а оно — концентрации гормона. Концентрации гормона в пробах сывороток рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по результатам измерений концентраций гормонов в стандартных образцах.

Надо подчеркнуть, что эта методика ИФА, в отличие от описанной выше методики РИА, является неконкурентной. Дело в том, что в реакционной смеси отсутствует меченый антиген и уровень связывания поликлональных антител (конъюгата) с антигеном, сорбировавшимся на моноклональных антителах, зависит только от концентрации антигена в пробе. Неконкурентные методики применяются и при иммунохемилюминесцентном анализе.

Иммунохемилюминесцентный анализ

Существует множество вариантов иммунохемилюминесцентного анализа. Мы опишем типичный вариант, который применяется для измерения уровней гонадотропных гормонов в современных автоанализаторах. В этом варианте для связывания гормона используются парамагнитные микрочастицы, покрытые моноклональными антителами, высокоспецифичными к данному гормону. Микрочастицы суспендируют в буферном растворе и добавляют к суспензии пробы сывороток или стандартные образцы. После кратковременной инкубации (10— 20 мин) микрочастицы со связавшимся гормоном осаждают в магнитном поле и несколько раз промывают. Затем микрочастицы вновь суспендируют в буферном растворе, и добавляют к суспензии поликлональные антитела к гормону, конъюгированные со щелочной фосфатазой. После отмывки несвязавшегося конъюгата к суспензии микрочастиц добавляют диоксетина фосфат. Под действием щелочной фосфатазы из диоксетина фосфата образуется диоксетин, испускающий кванты люминесценции. Интенсивность люминесценции, которую измеряют с помощью фотоумножителя, прямо пропорциональна концентрации гормона в образце.

Методы выявления аутоантител

Нарушения репродуктивной функции могут быть прямо или косвенно обусловлены аутоиммунными патологиями. Например, мужское бесплодие может быть вызвано аутоиммунной реакцией против сперматозоидов, а в патогенезе женского бесплодия может играть роль аутоиммунное заболевание щитовидной железы или надпочечников. Маркерами аутоиммунных патологий служат аутоантитела. Для выявления сывороточных аутоантител (например, антифосфолипидных антител, антител к йодидпероксидазе или 21-гидроксилазе) применяют ИФА, иммунохемилюминесцентный анализ и метод непрямой иммунофлюоресценции. В последнем случае в качестве антигенного субстрата используют криостатные срезы ткани, против которой направлена аутоиммунная реакция. Для выявления антиспермальных антител в сперме и шеечной слизи применяют метод микроагглютинации с латексными частицами, покрытыми антителами к IgA или IgG.

Другие методы

Для некоторых гормонов, например катехоламинов и серотонина, непросто создать надежные методы иммунохимического анализа. Дело в том, что эти вещества имеют очень небольшую молекулярную массу и против них трудно получить высокоспецифичные первичные антитела, даже моноклональные. Такие же сложности возникают и при разработке методов иммунохимического анализа стероидных гормонов и их производных (из-за высокой вероятности перекрестных реакций первичных антител с разными стероидами, имеющими очень большое антигенное сходство). Поэтому для точного количественного анализа таких веществ в последнее время все чаще применяют жидкостную хроматографию высокого разрешения с последующей масс-спектрометрией.

Нередко эндокринные нарушения, в том числе и нарушения репродуктивной функции, бывают обусловлены не патологическими изменениями уровней гонадотропных или половых гормонов, а мутациями их рецепторов. Для оценки функции рецепторов ранее применялись биологические тесты in vitro: у больного брали биопсию ткани, являющейся мишенью данного гормона, помещали биоптат в культуральную среду, добавляли к среде гормон и оценивали реакцию ткани на этот гормон. В наши дни мутации рецепторов выявляют путем определения последовательности нуклеотидов ДНК в соответствующих генах. ДНК для таких анализов обычно получают из лимфоцитов больного.