Критерии качества иммунохимического анализа гормонов

Любой метод должен быть специфичным, чувствительным, точным и иметь хорошую воспроизводимость результатов. Кроме того, методика анализа должна быть разработана так, чтобы можно было измерять уровни гормонов как в сыворотке, так и в цельной крови и в плазме, а иногда в моче и слюне (если речь идет, например, о стероидах). Еще один важный критерий — минимальное количество и максимальная простота операций, которые должен выполнять персонал лаборатории. Все эти критерии были разработаны до деталей уже в конце 1960-х гг., потому мы сделаем лишь несколько замечаний и комментариев.

Специфичность

Это самый важный показатель качества любого метода иммунохимического анализа. Специфичность можно определить как способность метода обнаруживать в пробе только определенное (анализируемое) вещество и не обнаруживать посторонние вещества, пусть даже очень сходные с ним по структуре. Иначе говоря, специфичность — это способность метода давать минимальное число ложноположительных результатов. Специфичность иммунохимического анализа определяется, прежде всего, специфичностью первичных антител. Она должна быть особенно высока при исследованиях гормонов с идентичными или похожими антигенными детерминантами. Например, аденогипофизарные гормоны ФСГ, ЛГ, ТТГ и ХГ состоят из двух полипептидных цепей — аир, причем а-цепи у них идентичны. Если для анализа какого-либо из этих гормонов, например ФСГ, в качестве первичных антител применяют низкоспецифичную поликлональную антисыворотку, то большая часть антител связывается с а-цепями всех четырех гормонов, поэтому результат измерения оказывается ложноположительным. Описанный феномен называют перекрестной реактивностью. Перекрестная реактивность наблюдается и при измерении пролактина, который относится к одному семейству с СТГ и плацентарным лактогеном (у всех этих гормонов весьма сходны N-концевые аминокислотные последовательности).

Специфичность поликлональных первичных антител можно повысить путем иммуносорбции антисывороток на колонках с соответствующими антигенами. Этот подход широко применялся до появления гибридомной технологии. В настоящее время в качестве первичных антител почти всегда используют высокоспецифичные моноклональные антитела, связывающиеся с антигенными детерминантами, характерными только для данного гормона.

Специфичность иммунохимического анализа зависит не только от свойств первичных антител, но и от множества других, иногда непредсказуемых, факторов. В частности, специфичность может снижаться из-за перекрестной реакции первичных антител с каким-то неизвестным компонентом в анализируемом образце сыворотки или плазмы. Бывают случаи, когда у какого-нибудь сывороточного белка изменяется конформация и из-за этого он приобретает антигенное сходство с анализируемым гормоном. Наконец, компоненты сыворотки могут внедряться в активные центры первичных антител и снижать специфичность их связывания с антигеном. В технологии иммунохимического анализа существует целый ряд способов предупреждения перекрестных реакций, однако все неожиданности предусмотреть невозможно.

Большинство иммунохимических тест-систем предназначено для измерения уровней гормонов в определенных биологических жидкостях человека (сыворотке, плазме, моче, слюне). Соответственно, и специфичность тест-систем установлена для этих биологических жидкостей. Если же такие тест-системы используются для анализа гормонов in vitro, например после инкубации эндокринных клеток в буферном растворе Кребса или Рингера или в какой-либо культуральной среде, необходимо особо проверить их специфичность в таких «нештатных» условиях.

Чувствительность

Чувствительность метода иммунохимического анализа можно определить как минимальную концентрацию вещества, которую можно измерить данным методом. Для оценки чувствительности используют стандартный образец с известной концентрацией гормона или другого антигена. Из этого образца путем последовательных разведений готовят пробы с убывающими концентрациями гормона. Таким образом, чувствительность тест-системы прямо пропорциональна степени разведения стандартного образца, при которой удается получить точный результат измерения. Чувствительность иммунохимической тест-системы зависит прежде всего от аффинности первичных антител, которые в ней используются. Кроме того, чувствительность зависит от типа иммунохимического анализа, на основе которого разработана тест-система. Как правило, чувствительность тест-систем на основе РИА более высока, чем у тест-систем на основе иммунохемилюминесцентного анализа и ИФА.

Для оценки чувствительности используют стандартный образец с известной концентрацией гормона или другого антигена. Из этого образца путем последовательных разведений готовят пробы с убывающими концентрациями гормона. Таким образом, чувствительность тест-системы прямо пропорциональна степени разведения стандартного образца, при которой удается получить точный результат измерения.

Чувствительность иммунохимической тест-системы должна быть такой, чтобы с ее помощью можно было измерять уровни гормона, находящиеся не только в диапазоне его нормальных концентраций, но и ниже этого диапазона. Поэтому разработчики тест-систем стремятся добиться чувствительности между 3-м и 5-м процентилями нормы либо в интервале между двумя и тремя стандартными отклонениями от нижней границы нормы. Например, диапазон нормальных концентраций ЛГ у женщин составляет 1,1—77 МЕ/л (2,3— 162 пмоль/л). Следовательно, чувствительность тест-системы для измерения ЛГ должна составлять примерно 0,4 МЕ/л (0,84 пмоль/л). Столь высокая чувствительность особенно важна, когда требуется измерять низкие концентрации ЛГ, в частности при дифференциальной диагностике первичной аменореи. В данной ситуации уровни ЛГ менее 10 МЕ/л указывают на вторичный (гипогонадотропный) гипогонадизм, а более высокие уровни — на первичный гипогонадизм. Иммунохимические тест-системы должны обладать высокой чувствительностью и в тех случаях, когда требуется уловить даже самое небольшое изменение концентрации гормона. Чаще всего такая задача встает при планировании и оценке эффективности заместительной гормональной терапии. Например, при лечении гипотиреоза дозу левотироксина подбирают по результатам измерений ТТГ. В норме уровень ТТГ колеблется между 0,4 и 4 мМЕ/л (2,9—29 пмоль/л). а современные тест-системы для измерения ТТГ имеют чувствительность не хуже 0,01 мМЕ/л (0,073 пмоль/л). Повторные высокочувствительные измерения ТТГ позволяют эндокринологу очень точно корректировать дозу левотироксина.

Чувствительность тест-системы зависит прежде всего от аффинности первичных антител, которые в ней используются. Кроме того, чувствительность зависит от типа иммунохимического анализа, на основе которого разработана тест-система (РИА, иммунохемилюминесцентный анализ, ИФА). Чувствительность РИА и иммунохемилюминесцентного анализа обычно более высока, чем чувствительность ИФА, поскольку в первых двух методах иммунохимические реакции протекают в жидкой фазе, за счет чего антигенные детерминанты гормонов становятся более доступны для первичных антител. Однако для научно-исследовательских целей производятся и высокочувствительные тест-системы на основе ИФА.

Точность

Это степень близости результата измерения концентрации гормона к ее истинному значению. Точность зависит от чувствительности и систематической погрешности метода: чем больше чувствительность и чем меньше погрешность, тем выше точность. Точность иммунохимических тест-систем оценивают по результатам измерений концентраций гормонов в стандартных образцах.

Воспроизводимость

Это способность метода иммунохимического анализа давать максимально близкие результаты при многократных измерениях концентрации гормона в одной и той же пробе в разных условиях (в разное время, в различных лабораториях). Для оценки воспроизводимости используют как стандартные образцы, так и пробы, полученные от больных. Чтобы добиться высокой воспроизводимости, лаборатория должна в совершенстве владеть методикой работы с данной тест-системой и проводить измерения в стандартных условиях (при одной и той же температуре, одних и тех же длительностях проведения реакций).

Специфичность, чувствительность и воспроизводимость в обязательном порядке указываются в инструкциях и паспортах ко всем имеющимся в продаже иммунохимическим тест-системам и иммунохимическим автоанализаторам. Тем не менее каждая лаборатория должна самостоятельно оценить все эти параметры, особенно воспроизводимость, в реальных рабочих условиях.