Матрикс хрящевой ткани

Биохимическая характеристика матрикса

Макромолекулярная структура матрикса

Прежде всего обращает на себя внимание высокое содержание гидроксипролина — аминокислоты, специфической для коллагенов. Поскольку в молекулах коллагенов один из десяти аминокислотных остатков — это остаток гидроксипролина, приведенные данные означают, что на долю коллагенов приходится не менее половины общей массы матрикса. Из всех видов соединительной ткани только сухожилия и дерма превосходят матрикс хряща по богатству коллагеном.

Кроме того, обращают на себя внимание и необычно высокие в сравнении с другими соединительными тканями концентрации гексозаминов и гексуроновых кислот. По этим показателям хрящ занимает первое место среди всех тканей организма. Гексозамины и гексуроновые кислоты (в хряще присутствует в основном глюкуроновая кислота) — моносахариды, из которых построены макромолекулы гликозаминогликанов.

Гликозаминогликаны являются вторым после коллагеновых белков преобладающим компонентом матрикса хряща. Они представлены главным образом хондроитин-4-сульфатом, хондроитин-6-сульфатом и кератансульфатом. Основная масса этих гликозаминогликанов содержится в макромолекулах большого, образующего агрегаты протеогликана — агрекана.

Главные гликозаминогликаны хрящевой ткани сульфатированы, т.е. содержат присоединенные сульфатные группы (эстерный сульфат). Это два изомерных хондроитинсульфата: хондроитин-4-сульфат и хондроитин-6-сульфат, — состоящие из чередующихся остатков глюкуроновой кислоты и галактозамина. Иначе говоря, хондроитинсульфаты представляют собой сополимеры D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилгалактозамина. К N-ацетилгалактозамину присоединена О-сульфатная группа, а различие между изомерами заключается в локализации этой группы, а в остальном их структура совершенно идентична.

По длине цепочки сульфатные группы гликанов распределяются неравномерно. Длина цепочки хондроитинсульфата в хрящевой ткани составляет в среднем 25—30 дисахаридов. При этом нередко молекулы имеют гибридное строение: в одной цепочке встречаются дисахаридные единицы как хондроитин-4-, так и хондрои-тин-6-сульфата. Третий сульфатированный гликозаминогликан хрящевого матрикса — кератансулъфат. Это единственный гликозаминогликан, не содержащий гексуроновой кислоты. Хондроитинсульфаты и кератансульфат входят также в молекулы «малых» протеогликанов — декорина, бигликана, фибромодулина и хондроадгерина, присутствующих в матриксе в небольших количествах. Четвертый гликозаминогликан хрящевой ткани — гиалуронан — не сульфатирован, его молекула построена из чередующихся остатков D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилгалактозамина. От всех других гликозаминогликанов он отличается наибольшей молекулярной массой, которая может достигать нескольких миллионов дальтон. На долю гиалуронана приходится лишь 1 % гексуроновых кислот матрикса.

Гликозаминогликаны, присутствующие в тканях в составе комплексных макромолекул протеогликанов, содержат гексуроновую кислоту и гексозамины в эквимолярных количествах, однако, в матриксе имеется избыток гексозаминов. Это означает, что в хрящевой ткани, помимо протеогликанов, присутствуют другие гликоконъюгаты, содержащие гексозамины, — представители класса гликопротеинов.

По данным G. Meachim и R.A. Stockwell, общая концентрация липидов в суставном хряще колеблется от 0,32 до 3,47 г на 100 г влажной ткани. Из этого количества 64,5 ± 5,1 % — нейтральные липиды, 34,5 ± 2,3% — фосфолипиды; около 74% нейтральных липидов составляют триглицериды и около 20 % — свободный и связанный холестерин. Наконец, суставной (гиалиновый) хрящ содержит в матриксе очень небольшое количество эластина. Следует подчеркнуть, что все приведенные цифры, характеризующие биохимическую структуру матрикса, являются усредненными, — они относятся к суставным хрящам в целом.

В действительности же, как показывают более детальные исследования, суставные хрящи отличаются значительной пространственной гетерогенностью количественных биохимических показателей, которая хорошо соотносится с морфологической картиной хряща. Эта биохимическая гетерогенность отмечается на двух структурных уровнях.

Первый структурный уровень может быть обозначен как микроуровень (молекулярный и надмолекулярный). Биохимические различия на этом уровне обнаруживаются при топографической дифференциации различных отделов суставных хрящей. Так, поверхностные слои хряща содержат больше коллагена и меньше протеогликанов, чем глубокие. Имеются также качественные различия протеогликанов между поверхностными и глубокими слоями хряща. Определенными особенностями биохимического состава отличаются зоны суставных хрящей в зависимости от падающей на них в физиологических условиях нагрузки. Эти различия, в частности, касаются неагрегирующих (малых) протеогликанов. При нарушениях биомеханических закономерностей функционирования суставов, в частности, усилении нагрузки на определенные зоны хряща, возрастают различия биохимических показателей.

Второй структурный уровень — это макроуровень {тканевой), который определяется биохимической гетерогенностью хрящевого матрикса, а именно, в разделении матрикса на различные зоны.

Структурные компоненты матрикса и их биосинтез

Коллагены

Коллаген II типа. Среди коллагеновых белков хряща резко преобладает коллаген II типа, на который приходится 80—95% общего количества коллагенов. Коллаген II типа специфичен для хрящевой ткани. Помимо хрящей он содержится только в белочной оболочке и стекловидном теле глаза, но оба эти объекта по биомеханическим свойствам весьма сходны с хрящом. Следовательно, вполне обоснован взгляд на способность к биосинтезу коллагена II типа как на одну из важнейших фенотипических характеристик хондроцитов. Появление коллагена II типа в эмбриональном периоде совпадает с началом хондрогенеза; также он появляется во всех случаях эктопической хондроидной метаплазии.

Коллаген 11 типа относится к классу главных структурных (интерстициальных) коллагенов, в который входят также коллагены I и 111 типов. К. Ktihn называет все эти коллагены «классическими», поскольку их макромолекула после завершения внутриклеточного и внеклеточного процессинга более чем на 97% имеет характерное для коллагенов строение: она представляет собой непрерывный трехспиральный домен, несущий всю необходимую информацию для сборки типичных поперечно исчерченных фибрилл. Объединяет «классические» коллагены также выраженная гомология первичной структуры α-иепей. Степень этой гомологии между а-цепями коллагенов I и II типов равна примерно 80 %. Основное отличие от коллагена I типа состоит в том, что коллаген II типа — гомотример. Его макромолекула построена из трех идентичных α-полипептидных цепей; соответственно его молекулярная формула α1(II)₃.

Среди различий в первичной структуре наибольший интерес вызывает разница в содержании остатков гидроксилизина: в α1(I)-цепи содержится 5 остатков, а в α1(II)-цепи — 23. Столь высокая концентрация гидроксилизина сопровождается увеличением количества связанных с ним углеводов. Кроме того, дополнительное содержание гидроксилизина создает условия для возникновения характерной для коллагена II типа внутримолекулярной поперечной связи, идентифицированной как гидроксилизин-5-оксонор-лейцин. Эти и некоторые другие особенности первичной структуры α1(II)-цепи коллагена плюс особенности, обусловленные посттрансляционными модификациями, обеспечивают высокую механическую прочность волокон коллагена II типа при меньшей по сравнению с коллагеном I типа средней толщине волокон.

Самые тонкие волокна коллагена II типа сосредоточены в территориальном (перицеллюлярном) матриксе.

За счет меньшей толщины волокон коллагена II типа увеличивается их поверхность, что благоприятствует эффективному взаимодействию коллагеновых волокон с гликоконъюгатами межфибриллярной субстанции экстрацеллюлярного матрикса хряща, в частности с агреканом. За счет этого взаимодействия, в котором в межтерриториальном матриксе участвуют малые протеогликаны декорин и фибромодулин, обеспечивается основная биомеханическая функция хряща — способность к обратимой деформации при сжатии. Достаточная же прочность на разрыв при относительно небольшой толщине коллагеновых волокон II типа достигается за счет дополнительных поперечных связей. Эти дополнительные интермолекулярные поперечные связи предположительно в виде гидроксипиридиния образуются при участии одного из минорных (малых) коллагенов хрящевой ткани — коллагена IX типа, речь о котором пойдет ниже. Этими же дополнительными поперечными связями объясняют низкую экстрагируемость коллагена II типа из ткани.

Центральная роль коллагена II типа в формировании биомеханических свойств хряща подтверждается тем обстоятельством, что наследуемые деформации скелета, связанные с поражением хрящевой ткани, являются, как правило, следствием дефектов биосинтеза и соответственно структуры именно этого коллагена.

В состав коллагена II типа входит так называемый артритогенный пептид, локализованный между 124-м и 402-м аминокислотными остатками α1(II)-цепи. Этот фрагмент молекулы, освобождающийся при деструкции суставных хрящей, обладает высокой иммуногенной активностью, которая вызывает дальнейшее прогрессирование заболеваний суставов, в частности при PA. Это аутоиммуногенное действие коллагена II типа опосредовано усилением продукции Т-лимфоцитами II-15 и фактора некроза опухолей-β синовиоцитами фибробластического типа (клетки β), а также ряда химических медиаторов, в том числе 11-8 и 11-17.

Минорные коллагены. В 1979 г. из хрящевой ткани был выделен и изучен ряд пептидов, структура которых отвечала критериям, достаточным для их отнесения к коллагенам. Вместе с тем обращало на себя внимание отличие их структуры от структуры коллагена II типа. Число таких пептидов быстро росло, вследствие чего сложилось впечатление о чрезвычайно выраженном генетическом полиморфизме коллагеновых белков хряща. Это впечатление оказалось несколько преувеличенным: дальнейшее изучение показало, что эти многочисленные пептиды являются фрагментами коллагеновых макромолекул V или VI типов. Поскольку их концентрация в ткани мала по сравнению с концентрацией коллагена II типа и в сумме она не превышает 10% от общего количества коллагена в матриксе хряща, их называют минорными (малыми) коллагенами. Из минорных коллагенов только два — коллагены IX и XI типов — специфичны для хрящевой ткани в такой же степени, как и коллаген II типа.

Коллаген IX типа — гетеротример: его макромолекула состоит из трехразличных α-цепей массой 84,72 и 66 кДа и описывается формулой α1(IX)α2(IX)α3(IX). Каждая а-цепь построена из трех типично коллагеновых (спирализованных) и четырех неколлагеновых доменов; один из последних обладает значительной гибкостью. Примерно у 70% молекул α2(IХ)-цепи ковалентно присоединена полимерная цепочка полимерного хондроитинсульфата. Предполагают, что этот гликозаминогликан играет роль поперечной связи, соединяющей молекулы коллагенов IX и II типов, которые входят в состав одних и тех же фибрилл. Судя по электронно-микроскопическим наблюдениям, молекулы коллагена IX типа располагаются на поверхности таких смешанных фибрилл, причем один из концевых неколлагеновых доменов приподнят над поверхностью. Это делает поверхность фибрилл шероховатой и способствует более прочному их связыванию с другими компонентами матрикса.

Методами иммунолокализации показано, что коллаген IX типа присутствует на поверхности даже самых тонких коллагеновых волокон, характерных для хондрона. Это обстоятельство наталкивает на мысль, что одной из возможных функций коллагена IX типа является регуляция диаметра волокон в процессе фибриллогенеза.

Аналогичную функцию приписывают коллагену XI типа, который в первое время после его открытия был известен под названием 1α2αЗα-коллагена. Его макромолекула имеет гетеротримерное строение, причем одна из α-цепей оказалась гипергликозилированным вариантом α1(II)-цепи. Коллаген XI типа в виде очень тонких фибрилл входит в состав тех же смешанных волокон хряща, которые содержат коллагены II и IX типов.

Таким образом, получается, что большие коллагеновые волокна суставных хрящей, различимые при СМ, представляют собой трех-компонентные гетеротипические структуры, сконструированные из макромолекул коллагеновых белков трех типов — II, IX и XI. Поэтому широко распространенное название этих волокон «коллагеновые волокна II типа» должно рассматриваться как условное, хотя оно оправдано тем фактом, что эти волокна состоят из коллагена II типа не менее чем на 90%.

Обычно причисляемый к минорным коллагенам хрящевой ткани коллаген X типа — компонент только провизорных, подвергающихся оссификации хрящей. Он является обязательным участником процесса оссификации и минерализации метаэпифизарных хрящей при энхондральном росте костей, он возникает также при всех других локализациях, в которых происходит замещение хрящевой костной ткани.

Особое место среди минорных коллагенов хрящевой ткани занимает коллаген VI типа. Мономерная гетерогенная макромолекула этого коллагена построена из трех различных полипептидных цепей: двух почти одинаковых — α1(VI) массой 150 кДа и α2(VI) массой 140 кДа, а также более длинной — α3(VI) массой 260 кДа.

Сильно разветвленные волокна коллагена VI типа организованы в тканях в виде нежной сеточки, оплетающей большие смешанные волокна коллагенов. В хрящевой ткани коллаген VI типа обнаруживается почти исключительно перицеллюлярно, внутри хондронов, причем не только в виде сети, но и в виде аморфных отложений. В других участках матрикса он содержится в минимальном количестве. Предполагают, что коллаген VI типа играет двоякую роль в поддержании структурной целостности хондрона. Во-первых, он соединяется с окружающей хондрон перицеллюлярной сетью коллагеновых волокон и стабилизирует коллагены, протеогликаны и гликопротеины в непосредственной близости к хондрону. Связь между микрофибриллами коллагена VI типа и большими гетеротипическими коллагеновыми волокнами хрящевой ткани и макромолекулами агрекана осуществляется и стабилизируется комплексами, состоящими из гликопротеина матрилина-1 и протеогликанов бигликана или декорина. Во-вторых, коллаген VI типа связывается со специализированными рецепторами на клеточной мембране хондроцита, обеспечивая не только пространственную фиксацию хондроцита, но и передачу информации от экстрацеллюлярного матрикса к ядру клетки.

Биосинтез коллагенов хондроцитами подчиняется, во-первых, универсальным закономерностям синтеза белков, и, во-вторых, тем специальным закономерностям биосинтеза коллагенов, которые были детально изучены на примере синтеза α1-цепи коллагена I типа.

Как при синтезе коллагена I типа, так и при синтезе коллагена II типа первоначальный продукт трансляции мРНК представляет собой препро-α-цепь мол. м. порядка 160 кДа, имеет сигнальный пептид и оба терминальных пропептида. Секреция проколлагена II типа из клетки происходит в более медленном темпе, чем секреция проколлагена I типа.

Имеющиеся сведения относительно биосинтеза минорных коллагенов полностью подтверждают их экспрессию хондроцитами.

Протеогликаны

Количественно преобладающим и особенно важным в функционально-биомеханическом отношении компонентом межволокнистой субстанции хрящевого матрикса являются большой протеогликан — агрекан. На его долю приходится около 5—10% массы влажной ткани. Строение его комплексной макромолекулы, к настоящему времени хорошо изучено. Центральным ядром этой макромолекулы служит белковый (полипептидный) стержень (стержневой белок) мол. м. 210 кДа. Стержневой белок состоит из нескольких доменов. На аминном конце находится глобулярный домен, в котором имеются одиночная и двойная петли; этот первый глобулярный домен G1 обеспечивает взаимодействие протеогликана с гиалуронаном при образовании агрегатов. Область связывания с гиалуронаном отделена коротким линейным пептидом от второго глобулярного домена G2, гомологичного по структуре G1. Далее следует линейная область, именуемая доменом связывания кератансульфата; она содержит 23 повторения одинаковых групп по 6 аминокислотных остатков в каждой. В каждой группе имеется остаток серина, к которому 0-гликозидной связью присоединены короткие цепочки кератансульфата. В этой области сосредоточено более 60% общего количества кератансульфата.

Домен связывания кератансульфата продолжается самым протяженным доменом стержневого белка — доменом преимущественного связывания хондроитинсульфата, в котором различают два субдомена. Первый состоит из 11 повторов аминокислотных последовательностей, каждый из которых содержит по 40 остатков; в каждом повторе сочетание остатков серина и глицина несет прикрепленные боковые цепи хондроитинсульфата, причем молекулярная масса каждой цепи равна в среднем 20 кДа. Второй, более длинный, субдомен состоит из 7 повторов по 100 аминокислотных остатков в каждом; в каждом повторе имеется отрезок длиной 30 остатков и 7 повторяющихся участков по 10 остатков. Эти участки содержат каждый не менее одной последовательности серин—глицин, несущей хондроитинсульфаты, сгруппированные в кластеры. В домене связывания хондроитинсульфата сосредоточено до 90 % общего количества хондроитинсульфата макромолекулы агрекана (остальные 10% присоединены к домену связывания кератансульфата) и около 40 % кератансульфата.

На карбоксильном конце стержневого белка располагается третий глобулярный домен G3, совершенно не похожий на два первых. Лектиноподобный субдомен этого домена способен связываться с моносахаридами (галактозой и фукозой), что создает возможности фиксации С-терминального отдела макромолекулы агрекана в экстрацеллюлярном матриксе.

Стержневой белок представляет собой гликопротеин: он содержит 50-60 олигосахаридов, присоединенных 0-гликозидной связью и состоящих из галактозамина, глюкозамина, галактозы и сиаловой кислоты в молярном соотношении 1:1:1:2. Кроме того, найдено около 15 богатых маннозой олигосахаридов, присоединенных N-гликозидной связью.

Описанная конструкция макромолекулы агрекана является, разумеется, идеализированной. Обнаружены значительные различия между разными хрящами. Так, в агрекане суставных хрящей преобладает хондроитин-6-сульфат, тогда как в агрекане ростовых хрящей больше хондроитин-4-сульфата. Кроме того, в суставных хрящах имеются возрастные различия в составе макромолекулы агрекана, а при исследовании суставного хряща бедренной кости собак найдены значительные индивидуальные вариации. Тем не менее следует подчеркнуть, что изложенные представления о строении агрекана, базирующиеся на результатах многообразных биохимических экспериментов, подтверждаются прямыми электронно-микроскопическими наблюдениями и являются в настоящее время общепринятыми.

В экстрацеллюлярном матриксе суставных хрящей макромолекулы агрекана не существуют в свободном состоянии. Они в качестве субъединиц (мономеров) объединены в стабильные мультимолекулярные агрегаты (отсюда название «агрекан») с молекулярной массой до 100 000 кДа. Основу агрегатов составляет гиалуронан, одна цепочка которого связывает большое число макромолекул агрекана. Считают, что одна линейная макромолекула гиалуронана массой в 1 тыс. кДа может нести на себе до 200 агрекановых субъединиц. Практически весь содержащийся в матриксе хряща гиалуронан (около 1 % общей массы ткани) вовлечен в формирование агреканов.

Одна гилауронная цепочка связывает большое число макромолекул агрекана— задействован домен агрекана G1. Для такого связывания необходимо 5 последовательных дисахаридных единиц гиалуронана; расчеты показывают, что в среднем одна полимерная цепочка гиалуронана массой 1,6 млн кДа может присоединить 200 агрекановых субъединиц. Практически весь гиалуронан, содержащийся в хрящевой ткани, вовлечен в формирование агреканов. С возрастом содержание гиалуронана в агреканах увеличивается (от 0,5 мкг/мг влажной массы ткани в возрасте 2,5 года до 2,5 мкг/мг — в возрасте 86 лет), а средний размер их в процессе старения уменьшается.

Аналогичные агреканы протеогликанов (содержащие не агрекан, а другой большой протеогликан — версикан) найдены в других тканях (аорта, нейроглия). Но только в хряще в агреканы объединено подавляющее большинство макромолекул протеогликанов, и только в хряще агрегаты достигают таких больших размеров. Это свидетельствует о большой функциональной значимости феномена агрегации для структурной организации хрящевого матрикса.

Образование агрегатов происходит спонтанно при смешивании в растворе, при нейтральном значении рН, экстрагированного из хряща агрекана и гиалуронана, причем достаточна очень низкая концентрация последнего — 0,01 %; показателем наступившей агрегации служит резкое повышение вязкости раствора. Роль гиалуронана в этом феномене абсолютно специфична: он не может быть заменен никаким другим полианионом. Точки присоединения двух ближайших друг к другу мономеров агрекана к гиалуронану удалены, как правило, не менее чем на 50—60 дисахаридов. В силу своих размеров и электростатических взаимодействий макромолекулы агрекана ориентированы в пространстве перпендикулярно цепочке гиалуронана. В результате возникает структура, которую сравнивают со «щеткой для мытья бутылок».

Дополнительное упрочение связи агрекана с гиалуронаном придает расположенный непосредственно у места прикрепления агрекана к гиалуронану связующий белок. Этот небольшой белок, состоящий из 339 аминокислотных остатков, и имеющий мол. м. около 45 кДа, в целом очень сходен с доменом G1 агрекана. Такое строение связующего белка позволяет ему быть присоединенным и к гиалуронану и к агрекану одновременно. Присоединение к агрекану, возможно, носит характер образования поперечной связи, которая имеет углеводную природу.

Исследование мышей с выключенным геном связующего белка показало, что роль этого белка в формировании хрящевой ткани весьма значительна. Большинство мышей погибало вскоре после рождения вследствие дыхательной недостаточности, вызванной неполноценностью хрящей гортани и бронхов. У выживших наблюдались карликовый рост, связанный с уплощением позвонков, укорочение конечностей и деформация черепа.

Биосинтез агрекана, подробно описанный в монографии В.Н. Павловой и др., представляет собой сложную систему скоординированных синтетических реакций, включающих сборку полипептидной цепи стержневого белка, присоединение к нему олигосахаридов (напомним, что стержневой белок имеет гликопротеиновую природу) и, наконец, сборку присоединенных к соответствующим локусам полипептидной цепи полимерных цепей гликозаминогликанов — хондроитинсульфата и кератансульфата. Используя данные о размерах мономера протеогликана, A. Dorfman рассчитал, что для завершения всего этого комплекса реакций и получения одной макромолекулы, готовой к включению в характерные для хрящевого матрикса агрегаты, должно образоваться примерно 25 тыс. ковалентных связей; причем в это число не входят связи, возникающие в процессах формирования промежуточных продуктов биосинтеза, информационных молекул и ферментов. Этот сложнейший процесс протекает с большой скоростью.

Первым этапом сборки цепочек хондроитинсульфатов является присоединение ксилозы к гидроксильным группам определенных остатков серина в стержневом белке. От своего нуклеотидного производного (уридиндифосфоксилозы) ксилоза переносится специфическим ферментом — ксилозилтрансферазой, первой из серии гликозилтрансфераз, участвующих в синтезе гликозаминогликанов протеогликана. Затем к остатку ксилозы аналогичным образом присоединяются два остатка галактозы, а затем происходит собственно сборка хондроитинсульфата, протекающая как поочередный перенос N-ацетилгалактозамина и глюкуроновой кислоты от соответствующих УДФ-нуклеотидов. Сборка присоединяемых к линейному домену стержневого белка гликозаминогликановых цепей происходит в цистернах комплекса Гольджи и завершается точно запрограммированным сульфатированием.

Внутриклеточно происходит формирование пространственной конформации (третичной структуры) глобулярных доменов стержневого белка. Сворачивание (складывание) этих доменов проходит несколько промежуточных стадий, и в результате готовые домены оказываются полностью гидрофобными снаружи и гидрофильными внутри.

По всей вероятности, с этим процессом сходна сборка кератансульфата, начинающаяся с присоединения N-ацетилгалактозамина к гидроксильным группам остатков серина или треонина в стержневом белке.

Синтез гиалуронана, необходимого для агрегации мономеров агрекана, также осуществляется хондроцитами. Гиалуронан интенсивно продуцируют хондроциты промежуточной зоны суставных хрящей, в которых найдена также экспрессия необходимых для этого ферментов — гиалуронансинтетаз (HAS-2, HAS-3). Синтез агрекана и синтез гиалуронана скоординированы между собой как в количественном отношении, так и во времени; и в обеспечении этой координации участвует синтезируемая теми же хондроцитами гиалуронидаза, устраняющая избыток гиалуронана. Сборка агрегатов протеогликанов происходит в экстрацеллюлярном матриксе. Это взаимодействие может происходить только вне клетки вследствие огромных размеров образующихся агрегатов. Эти размеры сопоставимы с размерами хондроцита.

Главная функция агрекановых агрегатов — механическая, они придают хрящевой ткани резистентность к сжатию и вместе с тем прикрывают коллагеновые волокна, предохраняя их от протеолического действия присутствующих в матриксе металлопротеаз.

Помимо агрекана, в экстрацеллюлярном матриксе суставного хряща обнаружен еще один большой (мол. м. 315 кДа) протеогликан, названный белком поверхностной зоны (SZP). Его гликозаминогликановый компонент содержит хондроитинсульфаты и кератансульфат. Присутствие большого количества олигосахаридов позволяет рассматривать SZP не только как протеогликан, но и как гликопротеин.

SZP экспрессируется хондроцитами поверхностной зоны суставного хряща и может служить специфическим фенотипическим маркером этой популяции хондроцитов. В более глубоких зонах хряща SZP отсутствует. Откладываясь на поверхности хряща, он является мультифункциональным белком: предотвращает адгезию клеток к поверхности хряща, задерживая тем самым развитие паннуса при РА; может стимулировать пролиферацию хондроцитов; принимает некоторое участие в формировании смазочных свойств СЖ. SZP присутствует также в СЖ и, вероятно, экспрессируется также синовиоцитами.

Наряду с большими протеогликанами в хрящевой ткани идентифицированы многочисленные малые протеогликаны. К ним относятся уже упоминавшиеся выше декорин, бигликан, фибромодулин, хондроадгерин, а также люмикан, эпификан и протеогликан, известный под названием PRELP.

Помимо своего участия в фибриллогенезе коллагенов (регулирующая роль), малые протеогликаны хрящевого матрикса взаимодействуют с факторами роста, в частности с факторами суперсемейства TGF-P, а также с протеолитическими ферментами, модулируя их влияние на клетки.

Гликопротеины

Экстрацеллюлярный матрикс хрящевой ткани содержит очень большое число неколлагеновых белков: не менее 40, по данным P.J. Roughley; большинство из них является гликопротеинами. В число гликопротеинов входят полипептидные компоненты (стержневые белки) протеогликанов, о которых говорилось выше, но известны и другие, весьма разнообразные гликопротеины.

Как и у всех протеогликанов, стержневой белок фибромодулина несет, помимо гликозаминогликанов, олигосахаридные группировки, что определяет двойственную природу многих гликоконъюгатов — одновременно и протеогликанов, и гликопротеинов.

Функции большинства неколлагеновых белков (гликопротеинов) хрящевого матрикса точно не выяснены. Некоторые играют адгезивную роль, другие, предположительно, регулируют процесс фибриллогенеза коллагенов. Несомненно, большинство из них являются элементами той сложной высокоорганизованной макромолекулярной конструкции, которую представляет собой матрикс.

Из промежуточной (интермедиарной) зоны суставного хряща человека выделен белок интермедиарного слоя хряща — CILP. В других слоях хряща этот гликопротеин отсутствует. Он состоит из одной полипептидной цепи с N-связанными олигосахаридами. Его мол. м. 91,5 кДа, а содержание в хряще с возрастом несколько увеличивается.

Следует упомянуть еще и небольшой белок (мол. м. 14,5 кДа) катионной природы — лизоцим, присутствующий в экстрацеллюлярном матриксе суставных хрящей и хрящей внесуставной локализации в нескольких (по меньшей мере в четырех) изоформах. Он обладает литической активностью по отношению к ряду микроорганизмов. Констатирован синтез лизоцима хондроцитами in vitro, что свидетельствует о его необходимости как структурного компонента хрящевого матрикса, но его функция остается неизвестной.

Вместе с коллагенами и протеогликанами гликопротеины матрикса экспрессируются хондроцитами. Как и при биосинтезе гликозаминогликанов, основная роль при сборке олигосахаридных групп гликопротеинов принадлежит специфическим гликозилтрансферазам: собранная на рибосоме полипептидная цепь становится акцептором первого моносахарида, перенос которого катализируется первой из ряда трансфераз. Донаторами моносахаридов, как правило, служат их нуклеотидные производные, но в отличие от гликозаминогликанов в биосинтезе гликопротеинов используют и другие доноры, относящиеся к липидам. По своей химической природе они представляют собой полипропенол-фосфатсахара, наиболее распространенным представителем которых является долихол, и полинепредельный спирт, углеродная цепь которого состоит из 90—100 атомов. Гликозилирование происходит в гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС).

В самом поверхностном слое суставного хряща присутствуют значительные количества альбумина, происходящего из сыворотки крови и попадающего в ткань хряща из СЖ.

Надмолекулярная структура матрикса

Как и во всех других разновидностях соединительной ткани, в экстрацеллюлярном матриксе хрящевой ткани многочисленные и разнообразные макромолекулы плотно упакованы, тесно соприкасаются друг с другом и вступают в различные взаимодействия, соединяясь с помощью как ковалентных, так и нековалентных связей.

Ковалентными связями соединены макромолекулы коллагенов II, IX и V—XI типов в составе больших объединенных коллагеновых волокон, обычно называемых волокнами коллагена II типа. К этим волокнам ковалентными же связями присоединены макромолекулы малых протеогликанов, главным образом бигликана. Благодаря этим связям коллагеновые волокна образуют в матриксе прочную жесткую трехмерную сеть.

Образование агрегатов протеогликанов также происходит путем формирования ковалентных связей между макромолекулами агрекана, с одной стороны, и макромолекулой гиалуронана — с другой. Эти ковалентные связи дополнительно укреплены связующими белками. В зрелой хрящевой ткани возникают еще и ковалентные связи между стержневым белком агрекана и неколлагеновым белком матрикса хряща (CMP).

Агрегаты протеогликанов, как можно судить по вязкости хрящевого матрикса, также составляюттрехмерную сеть, но менее жесткую и менее прочную по сравнению с коллагеновой. Обе эти сети сосуществуют в экстрацеллюлярном матриксе хряща, переплетаясь между собой. Ковалентные связи между ними отсутствуют. Более того, по всей вероятности, сети обладают даже некоторой подвижностью по отношению друг к другу, которая сопровождается возникновением трения. При этом коллагеновая сеть сжимает макромолекулы агрекана, препятствует распрямлению стержневого белка и гликозаминогликановых цепей. Вследствие этого агрекан в нормальном хряще занимает всего лишь 15% того объема, который он занимает в водном растворе.

Отсутствие ковалентных химических связей между коллагеновой и протеогликановой сетями возмещается комплексом механических (преимущественно при соприкосновении коллагеновых фибрилл с богатой кератансульфатом областью агрекана) и электростатических (за счет взаимодействия отрицательно заряженных групп в молекулах гликозаминогликанов и положительно заряженных групп в коллагеновых фибриллах) связей; скрепленная таким образом двойная сеть приобретает решающую роль в формировании биомеханических свойств хрящевой ткани, превращая ее в укрепленный волокнами композитный материал.

С биомеханической точки зрения по отношению к этой двойной сети функция остальных макромолекул экстрацеллюлярного матрикса хряща является вспомогательной. Они лишь модулируют биомеханические свойства главных структурных компонентов матрикса — коллагеновых волокон и агрегатов протеогликанов.

Как и в других разновидностях соединительной ткани, экстрацеллюлярный матрикс хряща не только сам по себе является высокоорганизованной конструкцией. Он представляет собой единое в функциональном отношении целое с хондроцитами, с которыми он связан рядом рецепторов, расположенных на клеточной мембране хондроцитов и обеспечивающих двустороннюю передачу сигналов — от клеток к матриксу и от матрикса внутрь клеток.

В числе рецепторов клеточной мембраны хондроцитов важное место занимают адгезивные рецепторы лигандов экстрацеллюлярного матрикса — интегрины. Нормальные зрелые хондроциты суставных хрящей располагают значительным количеством гетеродимерных интегринов α₁β₁,α₅β₁, α₅β₅ и несколько меньшим количеством гетеродимерных интегринов α₂β₁,α₃β₁, α₅β₃, и α₆β₁. Эти интегрины вместе со специализированным на связывании коллагена II типа интегрином а10р, могут служить рецепторами коллагенов, фибронектинов, ламинина и витронектина.

Среди других трансмембранных рецепторов хондроцитов, которые вместе с интегринами обеспечивают взаимодействие с матриксом, особое значение придают рецептору CD44. Гиалуронан служит главным лигандом для этого рецептора, который принимает активное участие в катаболизме этого гликозаминогликана. В опытах с культивируемыми in vitro срезами хрящевой ткани блокирование рецептора CD44, которое может быть вызвано олигосахаридными (содержащими по 6 моносахаридов) фрагментами макромолекулы гиалуронана, приводит к деструкции экстрацеллюлярного матрикса. Деструкция (хондролизис) проявляется нарушением тинкториальных свойств матрикса при гистохимическом исследовании. Эти опыты показывают, что взаимодействие хондроцитов с нативным полимерным гиалуронаном матрикса (содержание гиалуронана выше всего в перицеллюлярном матриксе в непосредственной близости от хондроцитов) — одно из условий поддержания структурной и функциональной целостности хрящевой ткани.

Катаболические процессы в матриксе хрящевой ткани

Результаты метаболических экспериментов с радиоактивными изотопами показывают, что в суставных хрящах взрослого человека за год происходит замена примерно 50% всех молекул протеогликанов, а по другим данным период полураспада зрелых макромолекул агрекана составляет 3,4 года.

Значительно медленнее обмениваются коллагеновые белки: для обновления 50 % молекул коллагенов требуется не менее 10 лет, причем это лишь минимальный уровень биосинтеза, необходимый для репарации незначительных повреждений суставных хрящей, которые неизбежно случаются на протяжении жизни. Большая же часть коллагеновых макромолекул, отложенных в период формирования хряща, сохраняется на протяжении всего онтогенеза. Тем не менее деградация структурных макромолекулярных компонентов матрикса происходит, причем осуществляется она ферментами, которые хондроциты секретируют в матрикс.

В катаболизме агрекана центральное место принадлежит линейному интерглобулярному домену стержневого белка, соединяющему глобулярные домены G1 и G2. В этом домене находится пептидная связь Asn341— Phe342, на которую действуют многие протеолитические ферменты: нейтральные металлопротеиназы (металлопротеазы — (ММР) — коллагеназы, желатиназы и стромелизин. В этом домене располагаются также пептидные связи — точки приложения действия катепсинов (В и L), плазмина, эластазы, урокиназы, матрилизина, коллагеназы нейтрофилов и коллагеназы фибробластов.

Стержневой белок агрекана в интерглобулярном домене расщепляют также протеолитические ферменты, агреканазы, составляющие особое семейство ADAMTS. Специфический локус действия агреканаз — пептидная связь Glu373-Ala374, но не менее значимо и их действие на пептидную связь Asn341—Phe342, которую, как только что было отмечено, расщепляют и другие металлопротеазы. Кроме того, агреканаза ADAMTS-1 расщепляет, вероятно, не одновременно, а последовательно и несколько других пептидных связей стержневого белка агрекана. В катаболизме стержневого белка, кроме агреканаз, принимает участие металлопротеаза ММР-3. Таким образом, именно в этом домене под воздействием протеолитических ферментов происходит разрыв полипептидной цепи стержневого белка агрекана, в результате которого большая часть (около 85%) макромолекулы освобождается из агрегата; связанным с гиалуронаном остается только небольшой кусочек, состоящий из домена G1 и фрагмента интерглобулярного домена. Освобожденная почти целиком макромолекула становится доступной действию других катаболических ферментов.

Процесс деградации агрекана, начатый агреканазами, завершают лизосомальные гликозидазы, в особенности гексаминидаза, и в несколько меньшей степени β-галактозидаза и гликозидсульфатазы. Эти гликозидазы, осуществляющие катаболизм гликозаминогликановых компонентов макромолекул протеогликанов, также экспрессируются и секретируются в матрикс хондроцитами.

Основной хрящевой коллаген — коллаген II типа — более стабилен, чем другие фибриллярные коллагены, благодаря более развитой системе интра- и интермолекулярных поперечных связей. Он доступен только для действия специфических коллагеназ из семейства ММР. Особенно активно на коллаген II типа суставного хряща действует коллагеназа-3 (ММР-3): активность этого фермента по отношению к коллагену II типа втрое превышает активность коллагеназы-1 (коллагеназы фибробластов, ММР-1).

Относительно немного известно о катаболизме малых протеогликанов и гликопротеинов хрящевой ткани. Малые протеогликаны отличаются от агрекана своей резистентностью к действию металлопротеаз. Эта особенность малых протеогликанов, которые стабилизируют сеть коллагеновых волокон, вероятно, предохраняет коллагены от деструкции на ранних этапах патологических процессов. В катаболизме олигомерного белка хрящевого матрикса (СОМР) существенную роль играет ММР-19.

Действие катаболических ферментов хрящевой ткани регулируется рядом модуляторов, часть из которых усиливает экспрессию ферментов клетками и повышает их активность, а другая часть оказывает на продукцию и активность ферментов противоположное — ингибирующее — влияние.

Среди факторов, ингибирующих катаболические процессы, в матриксе хряща центральное место занимают тканевые ингибиторы металлопротеазматрикса (TIMP). Действие TIMP-1, TIMP-2 и TIMP-4 направлено преимущественно на угнетение коллагенолитического эффекта металлопротеаз, которые оказывают лишь незначительное влияние на активность агреканаз. Напротив, TIMP-3 обладает мощным ингибирующим влиянием на обе основные агреканазы хрящевой ткани — агреканазу-1 (ADAMTS-4) иагреканазу-2 (ADAMTS-5).

Морфологическая характеристика матрикса хрящевой ткани

Межклеточное вещество (матрикс) обеспечивает уникальные биохимические свойства хрящевых тканей за счет взаимодействия уже описанных трех групп биохимических соединений: коллагенов, агреканов и интерстициальной воды. Другой особенностью матрикса хряща является его способность поддерживать хондроциты в дифференцированном состоянии.

Матрикс занимает около 95 % общего объема хряща. Пространственное распределение компонентов матрикса определяется векторами действия сил натяжения, сжатия, смещения и обусловлено спецификой того органа, компонентом которого является хрящ.

Важным компонентом матрикса хряща являются так называемые матричные пузырьки (везикулы). Эти мелкие, круглые (диаметром около 100-200 нм) ограниченные мембраной структуры образуются из отростков гипертрофированных хондроцитов, а затем поступают в матрикс хряща. Матричные пузырьки связывают и накапливают кальций. Они являются субстратом, где происходит отложение первых кристаллов солей кальция в виде гидроксиапатитов в процессе кальцификации хряща.

Как известно, классическое описание морфологии матрикса гиалинового хряща основано на изучении традиционных гистологических препаратов, окрашенных с использованием ряда гистологических и гистохимических методик. Однако при таком изучении закономерности архитектоники хрящевого матрикса не вскрываются. Для визуального наблюдения волокнистой стромы матрикса гиалинового хряща необходимо его демаскировать химическими агентами или использовать другие методические подходы.

Архитектоника матрикса суставного хряща и ее органоспецифические особенности

Волокнистая основа матрикса хряща, по данным Н.П. Омельяненко, состоит из индивидуальных коллагеновых фибрилл, не образующих коллагеновые волокна. Такие фибриллы спирализованы и ветвятся, а их толщина колеблется в пределах 20-40 нм и не одинакова в разных зонах хряща. В петлях волокнистого каркаса располагается основное вещество. Интерстициальные межфибриллярные пространства в хряще занимают до 37% общего объема ткани, а структурированные компоненты — волокна и клетки — соответственно 63 %. Суммарный объем межфибриллярных промежутков определяется поданным, приводимым тем же автором, как0,96 см3/г обезвоженной ткани, аудельная поверхность 1 г хрящевой ткани составляет 23,8 м2. Эти данные свидетельствуют об огромной величине поверхности межфибриллярных пространств. Последние позволяют судить об активности внутритканевого обмена в бессосудистом хряще. Внутритканевые пространства заполнены основным веществом и экстрацеллюлярной водой. Основное вещество является интерстициальной метаболической средой хряща, его ведущим компонентом являются протеогликаны (агрегаты агрекана). Локализация суставного хряща на границе между костью и СЖ при условии противоположного положения двух хрящевых пластов, разделенных суставной щелью, определяет органную специфику суставного хряща.

Особенности трофики и микроциркуляции в суставном хряще

Согласно морфологическим данным, хрящ относят к слабоваскуляризованным тканям, а суставной хрящ полностью лишен сосудов. Биохимические особенности хряща, обусловливающие его возможность выдерживать большие механические нагрузки, по-видимому, несовместимы со способностью обеспечивать бесперебойный ток крови по сосудистой сети. Механизмы этого явления объясняются особенностями макромолекулярной организации матрикса, препятствующие проникновению в него капилляров. Такими свойствами обладает только некальцифицированный хрящ, в ткань кальцифицированного хряща легко проникают сосуды. Хрящ выделяет специфический антиинвазионный фактор (AIF) (белок AIF был выделен из некальцифицированного гиалинового хряща и из клеток культуры хондроцитов). Он защищает хрящ от проникновения в него клеток эндотелия сосудов. Этими же обстоятельствами можно объяснить и отсутствие метастазов опухолей в хрящ.

Бессосудистый хрящ обладает своеобразными микроциркуляторными возможностями и, что особенно важно, эти пути обеспечены структурно. С этой особенностью хряща связана и возможность удаления продуктов метаболизма. Открытое сообщение матрикса хряща с синовией служат реальной основой для удаления продуктов дезинтеграции матрикса как в направлении сосудов подлежащей кости, так и в направлении суставной щели.

Присутствие протеогликанов в составе синовии подтверждает такую возможность. Речь идет именно о продуктах дезинтеграции хрящевой ткани. Обращенная в полость сустава поверхность хряща в норме свободна от погибших клеток, их обломков и продуктов деградации матрикса.

Поступление питательных веществ в ткань суставных хрящей путем диффузии из СЖ дополнительно стимулируется циклическими изменениями внутрисуставного давления, возникающими при движениях. Такая стимуляция наиболее эффективна в отношении диффузии высокомолекулярных веществ, в частности белков. Диффузия же относительно небольших молекул, имеющих основное значение в питании хондроцитов, очень слабо изменяется за счет изменений внутрисуставного давления. Циклические колебания внутрисуставного давления способствуют перемешиванию СЖ, благодаря чему в полости сустава улучшается транспорт молекул к поверхности хряща. Последнее особенно важно в условиях высокой вязкости синовии. Ведущая роль СЖ как источника питания суставного хряща лежит в основе обобщающей концепции В.Н. Павловой о синовиальной среде суставов.

Второй источник питания суставного хряща — диффузия веществ из кровеносных сосудов субхондральной кости. Этот способ поступления питательных веществ, характеризуемый во взрослом суставном хряще как второстепенный, вряд ли является таковым в растущих организмах. Особенности структуры и васкуляризации субхондральной кости позволяют говорить о значительной ее трофической роли по отношению к бессосудистому хрящу. Показано, например, что питание суставного хряща со стороны кости особенно хорошо выражено в тазобедренном, коленном и I метатарзофаланговом суставах взрослого человека.

Конечные артерии субхондральном кости на границе с хрящом образуют синусоиды, идущие параллельно поверхности хряща. Сосуды, проникая в зону кальцифицированного хряща, обычно отделяются от самого хряща тонкими костными трабекулами или пластинками костеподобной ткани (остеоидные пластинки). Таким образом, развитие и функционирование кровеносных и лимфатических сосудов в хряще несовместимы с его участием в обеспечении локомоторных актов. В связи с этим роль интерстициальных микроциркуляторных путей перемещения экстрацеллюлярной воды и метаболитов в хряще особенно велика и носит органоспецифический характер.

Формирующий вместе с СО внутреннюю выстилку суставной полости суставной хрящ является облигатным компонентом внутренней синовиальной среды сустава. Вместе с СО и СЖ суставной хрящ участвует в формировании специфической внутренней среды сустава как «органа», обеспечивающего локомоторные возможности организма.

Постоянный обмен метаболитами, проникающими в полость сустава из хряща с метаболитами, поступающими из кровеносных сосудов СО, и специфическим синтезируемым синовиоцитами продуктом — гиалуронаном — формируют в совокупности уникальную присущую только суставам внутреннюю синовиальную среду.

Патологический процесс любой этиологии локализуется во внутренней синовиальной среде сустава, поэтому параметры ее состояния крайне важны в диагностике заболеваний суставов.

Хрящ и кость в развитии опорных структур позвоночных

Большинство исследователей хондрогенеза и остеогенеза разделяют представление о генетической общности кости и хряща, о происхождении их из единого источника, которым является одна из популяций мезенхимных клеток зародыша, способная дифференцировать как в хрящ, так и в кость.

Тот факт, что хрящевая ткань преобладает в скелете современных низших позвоночных, а на ранних этапах эмбрионального развития высших позвоночных закладка скелета представлена по существу только хрящом, послужил основанием считать хрящ у позвоночных филогенетическим предшественником кости. В то же время палеонтологические исследования показали присутствие кости у древних ископаемых бесчелюстных и челюстных позвоночных в наружном защитном панцире, внутренней выстилке черепа и скелете.

По мнению M.L. Moss и Э.И. Воробьевой, вопрос о первичности или вторичности хряща и кости в филогенезе позвоночных может и должен решаться различно в отношении экзо- и эндоскелета. Хрящ не предшествует кости в экзоскелете и обязательно предшествует в эндоскелете. Экзо- и эндоскелет развивались независимо и гетерохронно у представителей разных групп позвоночных.

Древность хряща в эволюции позвоночных исчисляется в пределах 0,5 млрд лет. Появление кости в экзоскелете имеет аналогичную давность. Кроме того, степень окостенения скелета ряда древнейших форм у предков современных позвоночных выше, чем у ныне живущих их родственников. Далее излагается точка зрения авторов на процесс эволюции опорных структур в теле позвоночных. Эволюция опорных структур в теле позвоночных шла путем приобретения и объединения таких функциональных качеств, как плотность, прочность, эластичность, упругость, способность к деформации, для обеспечения широкого спектра адаптационных возможностей при изменении условий существования. Для роста организма, увеличения его размеров и массы эти качества должны были сочетаться со способностью клеток к пролиферации и высокой метаболической активностью.

Наибольшие возможности материализации этих качеств обнаружили клеточные популяции мезенхимального генеза. Пути реализации этого процесса были разными на различных этапах эволюции и осуществлялись в нескольких направлениях.

Одним из направлений, филогенетически более ранним, была организация прочных волокнистых конструкций, имеющих своей основой коллагеновые и неколлагеновые белки, секретируемые мезенхимными клетками. Сформировался первичный соединительнотканный скелет.

В процессе дальнейшей эволюции для приобретения большей плотности и твердости ткань первичного соединительнотканного скелета стала органической основой для минерализации — отложения углекислых и фосфорнокислых солей кальция. Так сформировался костный скелет.

Другое направление для достижения прочности и эластичности осуществлялось на базе клеточной дифференцировки тех же мезенхимальных клеток с использованием другого биохимического принципа, а именно усиления в матриксе протеогликанового компонента и приобретения способности к гипергидрации с возможностью отдавать воду и вновь обогащаться ею. Дифференцировка популяций мезенхимных клеток в этом направлении привела к формированию хрящевого скелета.

Путь обособления кости и хряща в филогенезе был длительным и «тернистым». Следами различных ступеней этого пути, следами «проб и ошибок» на нем являются известные и хорошо изученные в настоящее время аспидин ископаемых, остеоидные и хондроидные структуры низших позвоночных, рудиментарные ткани хондроидного типа, клеточный хрящ и др.

Развитие единых по генезу хряща и кости на ранних этапах эволюции шло независимо и обособленно. Однако на определенном этапе филогенеза позвоночных возрастающие функциональные потребности привели к необходимости взаимодействия кости и хряща — объединения их адаптационных возможностей в развитии и жизнедеятельности скелета. Наиболее ярко и последовательно это проявилось в энхондральном процессе и в формировании сочленений — диартрозов и симфизов, даже при соединении в суставе костей дермального происхождения, не имеющих провизорных хрящевых предшественников (вторичные хрящи).

Единство источников развития обусловливает тесное взаимодействие хряща и кости. Речь идет о взаимодействии структур, прошедших различные и далеко не однозначные пути дифференцировки в фило- и онтогенезе. Это взаимодействие осуществляется через объединение различных возможностей, реактивных и репаративных тенденций, имеющих свои регуляторные механизмы. Можно полагать, что именно в связи с этим места непосредственного контакта кости и хряща, а в равной степени, хряща и СО, являются точками наименьшей резистентности к действию патогенетических факторов.