Преимплантационная генодиагностика

Ее сочетание с тестом на анеуплоидию позволяет улучшить результаты ЭКО. ДНК для преимплантационной генодиагностики получают из полярного тельца, при биопсии на стадии дробления зиготы либо при биопсии бластоцисты.

Анализ ДНК полярного тельца проводится на стадии ооцита II порядка. Главный недостаток этого метода состоит в том, что для того, чтобы подтвердить генотип эмбриона, требуется пренатальная диагностика. Рекомбинация хромосом в 1-м делении мейоза может стать причиной ошибочного диагноза. В большинстве центров проводят биопсию эмбриона, что позволяет выявлять заболевания, унаследованные от любого из родителей. Материал для биопсии обычно получают на стадии дробления зиготы (на стадии восьми клеток), отбирая 1—2 клетки. Из-за сложностей, связанных с проведением диагностики на столь ограниченном материале (см. ниже), в идеале лучше проводить биопсию бластоцисты, поскольку она содержит до 300 клеток. Кроме того, при этом для биопсии можно брать клетки трофобласта, поскольку они более доступны и это не помешает надлежащему развитию эмбриона. Однако биопсию бластоцисты проводят далеко не во всех центрах из-за сложностей выращивания ее клеток в культуре и пониженной выживаемости таких бластоцист после криоконсервации. Тем не менее, применяя эти методы, удается достичь беременности, а со временем, по мере накопления опыта, их эффективность наверняка повысится.

Материал, полученный при биопсии, анализируют с помощью одного из двух методов: ПЦР или флюоресцентной гибридизации in situ. Лаборатории, выполняющие такие анализы, должны иметь соответствующий сертификат и в своем отчете указывать, какой метод применялся, а также приводить расшифровку полученных результатов. Тем не менее специалистам по лечению бесплодия крайне важно разбираться в молекулярно-генетических методах преимплантационной генодиагностики, области их применения и присущих им недостатках.

ПЦР

ПЦР лучше всего подходит для диагностики моногенных заболеваний; с ее помощью определяют также пол эмбриона, хотя теперь для этого чаще применяют флюоресцентную гибридизацию in situ. Чтобы выявить с помощью ПЦР мутацию в том или ином гене, необходимо еще до ЭКО знать, какую мутацию искать, и заранее подобрать условия реакции. В каждую реакцию в обязательном порядке включаются соответствующие положительные и отрицательные контроли, в противном случае результатам нельзя доверять. Необходимо помнить, что при проведении реакции может возникнуть ряд сложностей, в том числе:

1. отсутствие продукта ПЦР;
2. загрязнение образца;
3. потеря аллеля.

Кроме того, во многих центрах, если планируется применять для преимплантационной диагностики ПЦР, прибегают к интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, чтобы избежать возможных ошибок в диагностике, обусловленных внедрением в прозрачную оболочку дополнительных сперматозоидов.

Поскольку при преимплантационной генодиагностике количество ДНК-матрицы для ПЦР мало — как правило, несколько пикограммов, в то время как обычно при ПЦР применяются сотни нанограммов, приходится увеличивать число циклов амплификации. Если для ПЦР берется ДНК из единственной клетки (или нескольких клеток), часто требуется 35—60 циклов, тогда как при стандартной ПЦР (когда количество образца не служит лимитирующим фактором) — около 30. Другим выходом из положения является ПЦР с вложенными праймерами (или одним вложенным праймером): две последовательные реакции для целевой амплификации небольших количеств матрицы. В последние годы для анализа очень малых количеств ДНК использовались праймеры с флюоресцентной меткой, что позволило повысить чувствительность ПЦР примерно в 1000 раз и таким образом сократить число циклов амплификации.

Чтобы исключить загрязнение образца, следует очень тщательно готовить реакционную смесь и проводить реакцию; кроме того, в реакцию включают отрицательный контроль (реакционную смесь, содержащую все компоненты, кроме ДНК). Если в отрицательном контроле обнаружен продукт ПЦР, вероятно загрязнение пробы посторонней ДНК — в этом случае результатам ПЦР в остальных пробах доверять нельзя. Поскольку при использовании праймеров с флюоресцентной меткой число циклов ПЦР меньше, вероятность загрязнения образца ниже.

Потеря аллеля означает, что амплифицируется в основном один из аллелей, второй же амплифицируется очень слабо или не амплифицируется вовсе. Очевидно, что это имеет наибольшее значение при выявлении заболеваний с аутосомно-доминантным типом наследования. Если «потерянный» аллель содержит доминантную мутацию, то ошибка при анализе может привести к переносу в полость матки эмбриона, содержащего мутантный ген. Чтобы обойти эту проблему, можно одновременно амплифицировать другой близко расположенный фрагмент ДНК, обладающий высокой степенью полиморфизма (множественная ПЦР). Кроме того, как уже упоминалось, чувствительность ПЦР можно повысить, используя праймеры с флюоресцентной меткой.

Ассоциация по преимплантационной генодиагностике Европейской группы по репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) провела оценку диагностической точности ПЦР и флюоресцентной гибридизации in situ. По данным за 1999—2001 гг., в 81 случае после преимплантационной генодиагностики с помощью ПЦР проводилась пренатальная или постнатальная диагностика; при этом ошибки в диагностике заболеваний, наследующихся по законам Менделя, обнаружены в 5 случаях (6,2%). Повторная диагностика для подтверждения результатов проводилась лишь в половине случаев преимплантационной диагностики. Нужно также учитывать случаи, когда нельзя было провести биопсию или невозможно поставить диагноз.

Флюоресцентная гибридизация in situ

Этот метод заключается в том, что зонд (одноцепочечная ДНК), несущий флюоресцентную метку, гибридизуется с денатурированной ДНК из метафазной пластинки, отдельных клеток или тканей. В преимплантационной генодиагностике метод может применяться для:

1. определения пола эмбриона при Х-сцепленных заболеваниях, если нет возможности провести ПЦР;
2. выявления хромосомных транслокаций;
3. выявления изменений в числе хромосом;
4. выявления иных хромосомных аномалий, например анеуплоидии.

При исследовании на анеуплоидию возможны технические трудности, связанные с определением числа хромосом. Если для анализа берутся отдельные интерфазные клетки, очень трудно точно определить число сигналов (иными словами, хромосом), когда исследуешь одну-единственную клетку. Если виден только один сигнал, это может означать моносомию по данной хромосоме, но также и перекрывание сигналов либо то, что гибридизация зонда с одной из хромосом не прошла. Точно так же наличие трех и более сигналов может означать трисомию, но может быть вызвано техническими проблемами: двоением сигнала или аномальной флюоресценцией. Чтобы расширить возможности диагностики, можно одновременно применять хотя бы три зонда: на Х-хромосому, Y-хромосому и одну из аутосом, например на 18-ю хромосому. При этом лаборатория всегда должна жестко следить за качеством проведения гибридизации, чтобы точность диагностики была как можно выше, поскольку известно, что при исследовании 100 нормальных диплоидных клеток 100 пар сигналов для каждой хромосомы получить не удастся. Возможности диагностики расширятся, если появится возможность анализировать большее число клеток.

При выявлении этим методом транслокаций обычно применяют зонды, фланкирующие или захватывающие место транслокации. Поскольку непосредственно после получения яйцеклетки для ЭКО полярные тельца содержат конденсированные метафазные хромосомы, можно использовать зонды для «раскрашивания» хромосом в сочетании с зондами к центромерным участкам (альфа-сателлитные повторы) и определенным локусам. К сожалению, для клеток, взятых на стадии дробления зиготы или на стадии бластоцисты, такие зонды непригодны, поскольку хромосомы могут не находиться в метафазе и недостаточно конденсированы. Разработан метод, при котором используются зонды к субтеломерным участкам хромосом, специфичные для хромосом, между которыми происходит транслокация, и зонд к центромерному участку, проксимальному по отношению к месту транслокации. Такие зонды позволяют выявить в интерфазных клетках декомпенсированные транслокации, но не в состоянии отличить нормальные хромосомы от хромосом с компенсированными транслокациями.

Согласно отчету Ассоциации по преимплантационной генодиагностике Европейской группы по репродукции человека и эмбриологии, флюоресцентная гибридизация in situ дала ошибочный результат в 8 случаях из тех 145, когда вслед за преимплантационной диагностикой проводилась пренатальная или постнатальная (5,5%). Среди ошибочных диагнозов — два случая трисомии, одна мозаичная трисомия, одна моносомия и по одной компенсированной и декомпенсированной транслокации. Кроме того, при исследовании на анеуплоидию невыявленной оказалась трисомия по 21-й хромосоме. Как и в случае с ПЦР, подтверждение результатов флюоресцентной гибридизации in situ было проведено менее чем у половины женщин, прошедших преимплантационную генодиагностику.

Роль флюоресцентной гибридизации in situ при определении транслокаций на сегодняшний день не ясна, поскольку в 50—70% случаев, когда родители являются носителями компенсированных реципрокных транслокаций, при исследовании эмбрионов находят декомпенсированные транслокации. Приведенные в литературе данные о частоте успешного наступления беременности после исследования сильно колеблются, но по данным из трех крупных центров частота наступления беременности в пересчете на одно взятие яйцеклеток составляет 29%. Часть авторов сообщает, что преимплантационная генодиагностика снижает риск самопроизвольного аборта; однако неясно, повышает ли она частоту успешного завершения беременности по сравнению с естественным зачатием, поскольку более половины эмбрионов будут иметь аномалии и, таким образом, скорее всего в любом случае не выживут. Несмотря на то что преимплантационная генодиагностика с тестом на анеуплоидию уже многократно применялась при ЭКО, ни одно из опубликованных рандомизированных проспективных исследований не показало значимого роста числа благополучных исходов беременности. ЭКО с применением преимплантационной диагностики — инвазивная и дорогостоящая процедура, поэтому важно точно очертить практическую роль этого метода.

Ассоциация по преимплантационной генодиагностике Европейской группы по репродукции человека и эмбриологии

Сделать правильные выводы из результатов преимплантационной генодиагностики, проведенной методами ПЦР и флюоресцентной гибридизации in situ, на практике по-прежнему не всегда возможно. Согласно отчету Ассоциации по преимплантационной генодиагностике Европейской группы по репродукции человека и эмбриологии за 1999— 2001 гг., проведено 1197 циклов ЭКО; как показали результаты последующей пренатальной или постнатальной диагностики, преимплантационная генодиагностика с применением ПЦР дала ошибочный результат в 5%, а с применением флюоресцентной гибридизации in situ — в 6% случаев. Следует учитывать также, что последующую диагностику проводили менее чем в половине случаев, так что количество ошибочных диагнозов может быть занижено. Однако эти данные не означают, что в 94% случаев был поставлен надлежащий диагноз. По данным Ассоциации, общая частота наступления беременности после взятия яйцеклеток составляла 17%, биопсия была успешной в 97% случаев, а диагностику удалось провести только в 86% случаев. В общей сложности это означает, что правильный диагноз при преимплантационной диагностике был поставлен примерно в 85% случаев. Тех, кто собирается пройти преимплантационную генодиагностику, следует предупредить, что в 15% случаев правильный диагноз поставить не удается.